灑下百道層光，一窺微觀世界的生命律動──晶格層光顯微鏡

那些年，科學家如何「小」看世界

十七世紀起，Robert Hooke 與 Antoni van Leeuwenhoek 提出了顯微鏡的技術發展與改進，成為了微觀尺度生物學的關鍵基礎。隨著顯微鏡的改良與倍率的提升，我們也越來越了解微觀世界的樣貌。一沙一世界的美麗境界，就隨著一片片精心磨製的玻璃鏡片，向科學家敞開了偉大的航道。

Ernst Abbe 發現，這是由於光的波動性造成的干涉與繞射，導致顯微鏡所能得到的最小解析度，僅能是二分之一個用來觀測的光的波長。例如，如果利用波長是 500 奈米的黃光來觀測，所能得到的解析度就僅能有 250 奈米，雖還能看到細胞與細菌，但卻無法看清楚細胞內各胞器的樣貌。這一個波長的限制，也就是所謂的「繞射極限」。

為了突破繞射極限的阻礙，各種截然不同的思維與原理，催生了不依靠「可見光」來觀測微觀世界的顯微術，包含：利用觀測「電子」來顯示物體內結構、或表面樣貌的電子顯微鏡；利用原子間「凡得瓦力」的作用，來呈現物質表面樣貌的原子力探針顯微鏡；或利用近場光學的方式，將光源與樣品接近到只有數十個奈米，使距離拉遠時，光學的干涉與繞射現象無法顯現出來。但多數相關觀測技術，都需在相當限制的條件，例如真空環境、極薄的樣品切片等才得以進行，對於活體生物的觀察仍受到諸多限制。

由於生物細胞的胞器或生物分子等，並不盡然有顯著的顏色差異，因此不能單純僅依靠可見光與倍率放大來觀察；因此，螢光顯微術的核心原理是將外加的「螢光分子」，附著或接合在指定的生物分子上，如特定的蛋白質或特定的脂質等。由於這些特定的生物分子的分布，會與生物細胞內的結構有關，所以藉由觀察螢光的分布，我們就能了解生物細胞的微觀結構。

2014 年，由 Eric Betzig、Stefan W. Hell 和 William Esco Moerner 等人榮獲的諾貝爾化學獎，其重要性就是利用了螢光分子的化學特性，繞過了物理上繞射極限的阻礙，而達到超高解析度的生物影像。

如何看得小又快、久又深

但是，儘管有超高解析度的影像，並不盡然能表現出活體生物裡的動態樣貌。現有螢光技術中，常利用汞燈與雷射來激發螢光分子，但這些激發的能量，往往使螢光能顯現的時間非常短，激發光的能量也會對生物分子造成傷害，也就是所謂的「光毒性」。

然而，若能夠延長觀測的時間與增加激發能量，則又可以觀測到活體生物的動態表現、與更細緻的現象；此外，多數超高解析度的顯微技術，都侷限在空間解析度的強化，而無法看到活體生物的立體結構與變化。

這些面向導致螢光顯微術的發展，總是在這四個維度之中拉鋸取捨：看得小(空間解析度)、看得快(時間解析度)、看得久(光毒性)與看得深(影像深度)。

為了實踐活體生物分子的螢光顯微觀測，中研院陳壁彰助研究員師承 Eric Betzig ，與團隊研發出「晶格層光顯微術」，讓光源只精準地照射到生物樣品中所要觀察的焦平面上，這樣的照明方式，可以減少不必要的照明以減少光毒性，又因只照明到待觀測的切面上，而能有效減少背景雜光。

如下圖，傳統的螢光顯微術中，照明的光源是與觀測視角同向的寬場光源 (widefield)，使得觀測樣本整體都接受到激發光的能量，所要觀測的焦平面上下範圍，也因會被光源照射到，而產生背景雜光影響觀測品質。

為了解決寬場光源這樣過度照明的缺點，另一種「共軛焦顯微術」是利用針孔 (pin-hole) ，讓焦平面上的光源僅聚焦在極小的區域，但極小的焦平面上下的區域，仍然會被光照到而產生雜光。

如下圖，另一種傳統平面層光照明的方式，則是將照明的方向與物鏡觀測的方向垂直(正交)，使被照明的區域可以籠罩待觀測的焦平面，但這樣的照明區塊仍然太厚。

對於以上的問題，利用「貝索層光照明」的方式，可以有效地改善。因為貝索光束能在焦平面上形成一條寬度僅有 0.5 𝝁m 的光束，使照明的光源僅照射到待觀察的焦平面上，讓影像擁有極佳的光學切面效果；再利用與光束垂直的觀測物鏡，以寬場成像的方式收集螢光。因此，只要在樣本中移動貝索光束，就能逐條觀測出待測樣品的微觀樣貌。

用液晶螢幕圖形，製造出數百條層光

但是對於活體生物來說，僅依賴一條貝索層光掃描，仍無法精準且即時地觀測到生物體內的動態現象。因此，陳壁彰團隊應用了「構造化照明顯微術」(Structured Illumination Microscopy, SIM) 的思維，先利用一個二維的光學晶格，來侷限光的延展方向，而輸出一層光；再利用自行開發的「空間光調變器」(Spatial Light Modulator, SLM)，控制晶格紋路的呈現圖形。

空間光調變器，是一個由程式控制的液晶螢幕，螢幕上顯示了由理論計算出來的相位圖案，當入射的雷射光打到這個螢幕上的圖案時，如同透過一個光柵，使雷射光產生繞射、生成數百條的層光。利用數百條貝索層光同時掃描樣品時，僅需要「抖動」一下樣品，就能完成一次完整的掃瞄。

此外，由於可利用程式控制液晶螢幕上的相位圖案，因此研究者不會像傳統光學實驗一般，被所能取得的光柵元件特性侷限，而能精細且多樣化地微調出理想的層光狀況。

比起使用「單一貝索層光」來逐行掃描，陳壁彰團隊的方法不僅能維持良好的空間解析度，更因「數百條貝索層光」能快速完成掃描樣品的特性，而讓觀測結果有良好的時間解析度。再者，也能因精準地使用較低能量的光束，而維持低光毒性，來對活體樣本(例如細胞)進行長時間的追蹤觀測。

為活細胞拍微影像

晶格層光顯微鏡「良好時空解析度」與「低光毒性」的特性，可以讓研究者長時間觀測微觀生物世界的動態現象，例如：特別針對追蹤細胞內單分子的動態，來理解生物體內某些反應機制；或如下方影片動態，利用每秒一次的頻率完整掃描細胞，錄製長達十分鐘的影像，從而觀察到細胞分裂的完整流程與細節。

晶格層光顯微鏡的問世，引起眾多生物實驗室的高度興趣，特別是陳壁彰博士後時期的老師 Eric Betzig 非常強調顯微鏡的開發，一定要有生物學的「應用」！因此，當晶格層光顯微鏡的第一版建置完成後，當時 Eric Betzig 特別要求陳壁彰租車開了 10 多個小時，將顯微鏡整組打包、載到一個研究烏賊神經網路的暑期工作營隊中，將晶格層光顯微鏡介紹給其他研究社群，並陸續在一年內與 37 個不同生物實驗室合作，觀測了各式各樣的生物樣本。除了能快速累積實驗資料以改善顯微鏡，也開啟廣泛接觸到不同研究主題的契機。

目前，晶格層光顯微鏡已從它眾多的觀測成果，被驗證為觀測活體生物的利器。然而晶格層光顯微鏡在面對深度較深的樣品時，仍會因為樣品本身的像差，而影響成像能力。且生物體中仍有太多不透明物質，會嚴重阻礙活體生物的觀察。

2014 年回到臺灣後，陳壁彰在中研院擁有自己的實驗室，陳壁彰認為，未來的研究方向，除了引進在天文觀測中，用以抵銷大氣影響的自適應光學 (adaptive optics) 概念以外，也須開發出對應的樣品製備方式，例如利用化學方法將脂質替換掉，使樣品透明化以便於顯微觀測。

相較於多數生物學界慣行的研究方法，「活體生物顯微術」的概念仍相當新穎，其中對於活體的定義、樣品的製備方式、與之對應的研究方法設計，都尚有研發與推廣的空間。但無庸置疑的是，晶格層光顯微鏡的問世，已為觀測微觀世界的生命律動，灑下了百道一窺堂奧的洞察之光。